外囊蛋白复合体对于多种细胞类型中靶向囊泡融合至关重要，然而其在神经元中的功能仍未完全明了。研究人员通过转基因RNA干扰技术对突触前神经元中的外囊组分sec15进行敲减后，发现该突触出现了一系列意想不到的形态与生理缺陷。这些缺陷包括：缺乏关键突触前蛋白的活性区形成、突触前神经末梢分支增多、卫星样突触小结出现、刺激诱发的突触后电流振幅降低以及自发性突触囊泡释放频率减少。同时，研究人员还发现Sec15敲减后，突触前神经元释放的细胞外囊泡数量显著减少。这些效应可通过敲减已知与外囊复合体相互作用的Rab11蛋白进行模拟。sec15的RNA干扰表达导致突触前末梢内磷酸化Mothers against decapentaplegic蛋白水平升高，这提示骨形态发生蛋白信号传导增强。通过敲减wishful thinking基因以减弱骨形态发生蛋白信号传导后，Sec15敲减引发的部分形态学表型得以缓解，而其他表型则未受影响。对外囊复合体中多种蛋白分别进行敲减也呈现出与Sec15敲减相似的形态学表型。研究人员得出结论：Sec15作为外囊复合体的组成部分，对神经元突触的正常形成与功能具有至关重要的作用。据此提出模型：Sec15参与调控从循环内体至细胞膜的囊泡运输过程郑州配资网，并可能参与介导突触前释放的细胞外囊泡运输，这些过程对维持突触的正确结构与功能是必需的。
一、介绍
展开剩余97%轴突末梢是高度特化的细胞区域，靶向囊泡融合对于多种关键突触功能至关重要，包括轴突的定向生长、突触位点形成以及突触信号传递。阐明调控多种囊泡正确运输与融合的机制，对于理解突触的发育、维持及可塑性，以及这些机制在特定病理状态下的变化具有重要意义。
Sec15是一种最初在酵母中被鉴定为对囊泡胞吐作用至关重要的蛋白质。进一步研究发现它是外囊复合体的组成蛋白，该复合体包含Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10、Sec15、Exo70和Exo84等组分。外囊复合体对酵母的胞吐作用是普遍必需的，但在多细胞生物中，其对一般囊泡融合并非不可或缺，其作用更具多样性。在神经元中，外囊复合体的功能尤为引人关注，因为这里存在多种不同类型的胞吐作用，每种类型在时空释放机制上都有独特要求。既往研究表明，外囊复合体对神经元延伸、神经元靶向特异性、黏附分子定位以及可能的突触定位是必需的。然而，在迄今为止除一项研究外的所有研究中，均未发现外囊复合体参与突触传递过程。唯一的例外是一项针对外囊蛋白Exo70的研究，该研究表明该蛋白的缺失确实会引起有限的突触传递缺陷。
外囊复合体的部分特异性被认为源于其与特定囊泡蛋白的相互作用。在酵母中，外囊亚基Sec15与Rab同源蛋白Sec4结合。Rab是一类小型GTP酶蛋白，它们附着在囊泡表面以协助囊泡在细胞内的正确运输。Sec4存在于分泌囊泡上，这种相互作用可能将囊泡与外囊复合体连接起来。在多细胞生物中，Sec15可与Rab11结合（该Rab蛋白与来自循环内体的囊泡相关），也可与Rab3结合（该Rab蛋白与突触囊泡相关）。研究表明，Rab11/Sec15的结合对于HeLa细胞和上皮细胞中将回收蛋白转运至细胞表面的囊泡胞吐作用至关重要。
本研究在筛选能改变突触前活性区蛋白定位的基因时，分离出sec15基因。研究发现，减少Sec15会导致突触结构和功能出现缺陷。在突触前运动神经元中特异性敲除Sec15，会导致含有必需突触前蛋白Bruchpilot的活性区数量减少。此外，敲低Sec15还会引起诱发性和自发性突触后电流缺陷，以及突触末梢出现不恰当的出芽或分支。与Sec15和Rab11相互作用的观点一致，突触前敲低Rab11能够模拟在UAS-sec15 RNAi品系中观察到的表型。研究还发现，敲低Sec15会破坏突触前神经元释放细胞外囊泡的过程，而这一过程已知依赖于Rab11。另外，Sec15敲低还增强了骨形态发生蛋白信号传导，提示观察到的表型效应可能是该信号通路激活的结果。然而，通过敲低骨形态发生蛋白受体Wit来阻断该信号通路的增强，并未消除在Sec15 RNAi敲低中观察到的形态学或突触传递表型，这表明Sec15敲低后的表型是直接和间接效应共同作用的结果。此外，研究发现敲低sec3、sec5、sec6、sec8、sec10和exo84也会导致与sec15相似的形态缺陷，提示整个外囊复合体都参与其中。综上所述，本研究数据表明Sec15，很可能整个外囊复合体，在调控神经元突触生长和确保其正常功能方面发挥着重要作用。
二、材料与方法
01.果蝇品系
果蝇于25°C条件下饲养于标准培养基中。野生型对照为Canton S品系，与elav-Gal4及UAS-DCR2进行杂交。本研究使用的突变品系包括wit A12、wit B11、endoAEy02730及rab3rup。研究中使用的UAS-RNAi品系包括：sec15 TRiP.JF02649、sec5 TRiP.GLC01676、sec6 TRiP.JF02623、exo84TRiP.JF03139、rab11 TRiP.JF02812、wishful thinking TRiP.JF01969、sec10 TRiP.JF02633、saxophone TRiP.JF03431，以及来自维也纳果蝇资源中心的rab3 KK 108633、sec15 KK 101708、sec15 GD 12109、sec3 GD 10687、sec8 KK 101531。RNAi抗性sec15序列由VectorBuilder合成，经密码子优化的序列被克隆至pUAStB载体，通过phiC31整合酶注入果蝇attP2位点。
02.电生理学
实验在25°C饲养的三龄果蝇幼虫中进行。幼虫在冰浴低钙HL-3培养基中解剖并切断节段神经，随后更换为室温改良HL-3培养基。使用充灌3M KCl、电阻为10-20 MΩ的电极刺入幼虫A3或A4节段的第6号肌肉。通过Axon Instruments Axoclamp 2B放大器将肌肉钳制在-70 mV保持电位，记录自发性电流。将节段神经吸入刺激电极，给予3 ms刺激以充分激活神经肌肉接头突触电流。诱发突触电流通过ITC-18数字化仪采集，并使用Patchmaster软件记录。自发性事件记录1分钟，其平均振幅与频率通过Mini Analysis Software分析。对于诱发兴奋性接头电流，使用玻璃刺激电极以1.5倍阈值电压刺激节段神经断端1 ms。刺激由Master 8刺激器与Isoflex刺激隔离单元控制持续时间与振幅。0.5 Hz连续10次刺激诱发的电流通过定制程序进行离线平均。在刺激序列实验中，神经接受5次超阈值脉冲刺激（频率20 Hz），序列间隔5秒，连续5个序列的平均值用于计算易化比。
03.免疫组织化学
三龄幼虫在PBS中解剖，4%多聚甲醛固定20分钟。样品经含0.1% Triton X-100的PBS洗涤，5%正常山羊血清封闭30分钟后，于一抗溶液中4°C孵育过夜。随后进行二抗孵育及PBS洗涤，最终保存于70%甘油。使用的一抗包括：小鼠抗BRP、兔抗DGluRIII、兔抗磷酸化MAD、小鼠抗神经胶质蛋白、小鼠抗sec15、兔抗GFP、小鼠抗β-微管蛋白。二抗使用Cy3标记山羊抗小鼠、Alexa-488标记山羊抗兔及Cy5标记山羊抗HRP，稀释比例为1:1000。
04.成像与分析
样品使用尼康C2共聚焦显微镜或配备Airyscan 2探测器的蔡司激光扫描显微镜980成像。同一实验所有基因型在相同增益下成像，确保信号无饱和。仅分析肌肉4上的1b型神经肌肉接头。
共聚焦图像使用MetaMorph与FIJI软件分析，Airyscan图像通过Zen Blue软件处理。统计采用单因素方差分析结合Tukey事后检验进行多组比较，两组比较采用学生t检验。所有统计数据均表示为均值±标准误。BRP与DGluRIII斑点通过人工计数，无BRP对应的DGluRIII簇计为无对应DGluRIII簇。卫星样突触小结定义为从主链发出的单个突触小结，连续两个及以上突触小结计为分支。细胞外囊泡分析通过Image-J划定HRP标记的神经元膜区域，将该区域扩展1.5 μm后，计算两个区域的积分密度与面积差值得出释放量。
05.蛋白质印迹
三龄幼虫脑组织于Laemmli样品缓冲液中匀浆，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印至硝酸纤维素膜。使用的一抗为豚鼠抗sec15与小鼠抗β-微管蛋白，二抗为680RD山羊抗小鼠与800CW驴抗豚鼠。通过LI-COR CLx Odyssey红外成像系统定量β-微管蛋白与sec15条带强度，将sec15强度归一化至相应泳道的β-微管蛋白强度，结果以最大响应的百分比表示。
06.实验设计与统计分析
所有统计分析通过Prism软件完成。数据以均值±标准误表示。两组比较采用非配对学生t检验，三组及以上比较采用单因素方差分析结合Tukey事后检验。显著性水平表示为：不显著，或小于0.05、0.01、0.001。图中以星号标示显著性差异。所有实验统计详情见补充表。
三、实验结果
01.Sec15 RNA干扰增强Rab3突变表型
果蝇幼虫神经肌肉接头由发育过程中与肌肉接触的运动神经元构成。随着发育进行，肌肉体积增大，为确保对生长中肌肉的兴奋能力，与之接触的突触前神经元亦相应扩大。神经肌肉接头在发育中的扩展是通过连续添加突触小结实现的，形成一串偶有分支点的突触小结链。每个小结内存在多个活性区——即突触囊泡释放位点，此处聚集着高效囊泡释放所需的突触前蛋白，它们与肌肉膜上成簇的突触后谷氨酸受体相对分布。
先前研究已鉴定出一种名为Rab3的突触囊泡蛋白，其对某些突触前蛋白在突触前活性区的正确表达至关重要。在野生型神经肌肉接头中，突触前蛋白BRP定位于几乎所有活性区。然而在rab3突变体及rab3 RNA干扰敲低品系中，BRP仅在一小部分活性区聚集成增大的簇状结构，导致大多数活性区缺乏必需突触前蛋白。目前Rab3辅助突触蛋白定位的机制尚不明确。为探究Rab3功能，研究人员试图鉴定可能协助Rab3参与活性区发育的基因。为此，我们在已知能引起部分活性区BRP斑点缺失的rab3 RNA干扰敲低背景下，开展了正向遗传学筛选。使用rab3 RNA干扰品系可提高鉴定与rab3存在遗传互作基因的可能性，因为相较于rab3无效突变体，rab3 RNA干扰敲低表现为亚效等位基因效应。因此，通过筛选能增强Rab3 RNA干扰亚效等位基因的对应表型、使之匹配Rab3无效突变体表型的基因，可鉴定可能参与同一分子通路的基因。
我们筛选了RNA干扰文库以鉴定能增强rab3 RNA干扰敲低表型的基因。利用针对rab3的UAS-RNA干扰转基因表达导致的突触前BRP错误定位作为敏感背景，研究人员对1000多个基因进行了表型修饰能力筛选。将含有特定UAS-RNA干扰转基因的果蝇品系与携带UAS-rab3 RNA干扰、UAS-dicer2及神经元elav-Gal4驱动因子的品系杂交，获得同时敲低rab3与另一基因的子代。通过该方法，研究人员分离出数个能增强UAS-Rab3 RNA干扰表达所致对应表型严重程度的候选基因，其中一个基因编码名为Sec15的蛋白。
与单独表达UAS-rab3 RNA干扰相比，在神经元中同时驱动UAS-sec15 RNA干扰与UAS-rab3 RNA干扰，会导致BRP阳性突触前活性区对应的谷氨酸受体簇百分比显著下降。鉴于RNA干扰可能存在脱靶效应，研究人员测试了靶向sec15基因其他区域的另两种RNA干扰品系，发现它们同样引起谷氨酸受体簇与BRP对应百分比类似下降，表明该表型特异源于Sec15的敲低。
图1. Sec15增强rab3活性区对应表型。A) 表达rab3 RNAi转基因单独作用（UAS-DCR2, elav-Gal4/+; UAS-Rab3 RNAi/+）或与三种不同sec15 RNAi转基因之一联合作用（+sec15 RNAi105126、+sec15 RNAi35161、+sec15 RNAi27499）的幼虫肌肉4神经肌肉接头1b型突触小结代表性共聚焦图像。上方图像显示α-BRP（红色）与α-GluRIII（绿色）共标记，下方图像仅显示α-BRP（红色）信号。比例尺为2微米。B) 野生型幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/+）或表达三种UAS-sec15 RNAi转基因之一（sec15 RNAi105126、sec15 RNAi35161、sec15 RNAi27499）的幼虫肌肉4神经肌肉接头α-BRP（红色）与α-GluRIII（绿色）标记共聚焦图像。比例尺为2微米。C) 根据A所列基因型统计的BRP斑点对应GluRIII簇百分比柱状图。***表示采用单因素方差分析与Tukey事后检验在p<0.001水平存在显著差异。D) 根据B所列基因型统计的BRP斑点对应GluRIII簇百分比柱状图。**与***分别表示采用单因素方差分析与Tukey事后检验在p<0.01或p<0.001水平存在显著差异。E) rab3无效突变体rab3rup（rab3rup/rab3rup）及其与sec15 RNAi105126转基因联合作用（+sec15 RNAi105126）的幼虫肌肉4神经肌肉接头突触小结α-BRP（红色）与α-GluRIII（绿色）标记共聚焦图像。比例尺为2微米。F) 根据E所列基因型统计的BRP斑点对应GluRIII受体簇百分比柱状图。
sec15基因编码的蛋白作为多蛋白外囊复合体的组成部分，参与靶向囊泡胞吐作用。先前的体外生化证据表明Sec15可与Rab3结合。这一发现与我们观察到的Sec15敲低会增强rab3活性区表型现象相结合，促使研究人员提出假设：Sec15可能作为Rab3效应因子调控活性区发育。该假设预测单独敲低Sec15应产生与Rab3敲低相似的对位表型。
深圳市富临神通科技有限公司（原“东莞市富临塑胶原料有限公司”）是 AMPI中国代理商，我们为客户提供Master-8、Master-9等电刺激产品。
在野生型背景下驱动UAS-sec15 RNAi转基因表达后，约20-30%的突触后谷氨酸受体簇未与BRP斑点对应，这表明Sec15缺失本身会影响BRP定位，而非仅在与Rab3缺失协同作用时产生影响。该效应不具Gal4驱动子特异性，因为使用elav与vGlut驱动子均获得相似结果。观察到的sec15表型与Rab3表型并不相似：尽管存在对位异常，但剩余的BRP斑点并未出现如Rab3敲低和突变体中可见的增大现象，这提示Rab3与Sec15通过独立机制发挥作用。
为深入探究Sec15是否与Rab3作用于同一机制通路，研究人员进一步检测了sec15敲低效应能否被Rab3完全缺失所掩盖。同时敲低sec15与rab3产生的活性区表型强度与rab3rup无效突变体相似。研究人员假设：若Rab3与Sec15作为同一分子机制或通路的组成部分共同作用，则在rab3rup无效突变体中敲低sec15不应增强其表型；反之，若两种蛋白通过不同机制或通路发挥作用，则应产生叠加效应。为区分这两种可能，研究人员在rab3rup突变背景下驱动UAS-sec15 RNAi转基因表达。比较发现，与rab3无效突变体相比，在rab3rup背景下敲低Sec15会导致BRP对应的谷氨酸受体簇百分比进一步下降，表明Rab3与Sec15独立作用于突触对位减少过程。
02.Sec15 RNAi引发多种突触形态缺陷
本研究表明Sec15敲低导致活性区发育缺陷。接下来研究人员探究了Sec15缺失是否会引起神经肌肉接头发育的其他缺陷。先前对果蝇外囊亚基的研究显示sec15无效突变具有致死性，突变个体无法存活至三龄幼虫阶段。基于此，研究人员通过抗HRP抗体染色分析了表达三种不同UAS-sec15 RNAi转基因幼虫的总体神经肌肉接头形态。所有三种UAS-sec15 RNAi转基因的单独表达均导致突触前神经末梢分支增加，并在除一种构建体外均观察到从主支较大突触小结上延伸出的小型突触小结增多现象。这些从主支发出的小型突触小结常被称为卫星样突触小结。蛋白质印迹实验证实，表达uas-sec15 RNAi构建体后Sec15蛋白水平确实降至对照组的25%左右。因此，Sec15缺失不仅导致突触前活性区BRP聚集缺陷，还会引起轴突末梢生长模式改变。
图2. Sec15敲低导致果蝇神经肌肉接头显著形态表型。果蝇三龄幼虫肌肉4神经肌肉接头共聚焦图像。样品经抗HRP抗体标记（蓝色）。A) 野生型幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/+）或表达三种UAS-sec15 RNAi转基因之一（sec15 RNAi105126、sec15 RNAi35161、sec15 RNAi27499）的幼虫肌肉4神经肌肉接头α-HRP（蓝色）标记共聚焦图像。比例尺为20微米。B) 显示A所列基因型神经肌肉接头平均分支数的柱状图，及C) 平均卫星样突触小结数的柱状图。***表示采用单因素方差分析与Tukey事后检验在p<0.001水平存在显著差异。D) 野生型与Sec15 RNAi幼虫蛋白质印迹结果，分别使用抗sec15与抗β-微管蛋白抗体染色，在预测分子量88.7 kDa（Sec15）与49.9 kDa（β-微管蛋白）处显示条带。E) 图2D所示蛋白质印迹中Sec15强度定量柱状图。*表示采用学生t检验在p<0.05水平存在显著差异。
三种靶向sec15不同区域的独立RNA干扰均产生相似表型，这为特异性靶向sec15提供了有力证据。为进一步验证特异性，研究人员利用RNAi抗性的UAS-sec15构建体，通过Elav-Gal4驱动子在神经元中表达，以挽救sec15敲低导致的表型。将该UAS-sec15构建体与sec15 RNAi共表达后，发现对位百分比、神经肌肉接头分支数及卫星样突触小结数量均恢复至野生型水平。这些数据结合三种不同sec15 RNAi所呈现的表型，表明观察到的表型确由Sec15特异性敲低所引起。
图3. 表达RNAi抗性sec15可挽救sec15敲低表型。为验证RNAi构建体的特异性，研究人员将RNAi抗性UAS-Sec15与sec15 RNAi共同表达进行挽救实验。A) 野生型、sec15 RNAi及sec15 RNAi + uas-sec15（挽救组）神经肌肉接头代表性图像。神经肌肉接头经HRP染色（白色）。比例尺为20微米。B) 显示对位关系的神经肌肉接头局部放大图像。神经肌肉接头经α-GluRIII（绿色）与α-Brp（红色）染色。比例尺为2微米。C) DGluRIII与Brp斑点的对位定量（左图）、每个神经肌肉接头卫星样突触小结数量（中图）及每个神经肌肉接头分支数量（右图）。D) α-GluRIII（绿色）与α-Brp（红色）染色的神经肌肉接头代表性图像。比例尺为1微米。所有统计图中，*表示采用单因素方差分析结合Tukey事后检验在* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001水平存在显著差异。
03.Sec15敲低导致突触生理功能缺陷
鉴于观察到Sec15敲低既引起神经肌肉接头结构形态缺陷，也导致更特异的活性区缺陷，研究人员进一步探究了Sec15缺失是否会造成突触功能缺陷。先前在果蝇中使用外囊组分基因突变等位基因的研究曾指出其对突触传递无影响，但这些研究受限于外囊突变体的致死性。RNA干扰技术的运用使我们能在果蝇中更直接地探讨该问题，因为神经元特异性敲低不会导致致死。通过elav-Gal4驱动子在神经元中特异性敲低sec15，可使果蝇存活至蛹期，从而直接评估突触前Sec15缺失的效应。
为评估神经肌肉接头功能，研究人员首先检测了三龄野生型幼虫与表达UAS-sec15 RNAi转基因幼虫的自发性突触电流。表达sec15 RNAi的神经肌肉接头微型兴奋性接头电流振幅与野生型无差异，但其频率急剧下降。随后测试了节段神经刺激引发的突触反应，发现sec15敲低导致诱发兴奋性接头电流振幅大幅降低。由于微型兴奋性接头电流振幅未变，该结果源于每次刺激释放的突触囊泡数量（量子含量）显著减少。量子含量降低可能源于释放位点囊泡释放概率下降。为确定UAS-sec15 RNAi表达是否引起释放概率变化，研究人员检测了突触对20赫兹频率下连续5次刺激序列的反应，并计算了易化比（该测定常用于评估释放概率）。表达三种UAS-sec15 RNAi中两种的幼虫神经肌肉接头显示出显著更大的易化比，提示初始释放概率降低。为进一步验证所用RNAi针对该表型的特异性，研究人员在添加RNAi抗性sec15构建体的条件下重复了上述实验。发现该构建体完全挽救了微型兴奋性接头电流频率的下降，而兴奋性接头电流振幅的挽救呈现向野生型水平恢复的趋势，但未达到统计学显著性。因此，Sec15减少不仅导致形态表型改变，还会引起自发性与刺激诱发突触电流的显著缺陷。
图4. Sec15敲低导致神经肌肉接头多项生理缺陷。A) 钳制于-70 mV的果蝇三龄幼虫第6号肌肉双电极电生理记录。显示野生型（elav-Gal4, UAS-DCR2/+）及表达三种UAS-sec15 RNAi转基因之一（sec15 RNAi105126、sec15 RNAi35161、sec15 RNAi27499）幼虫自发性释放事件（微型电流）的代表性波形。插图为野生型记录的放大区段，展示微型事件动力学特征。B) 针对A所列基因型，单次超阈值电脉冲诱发刺激电流的代表性记录。图示为连续10次刺激的平均电流波形。C) 图中所示基因型在20赫兹频率下连续5次刺激所见电流易化现象的代表性记录。这些记录用于计算易化比（第5次兴奋性接头电流振幅除以第1次振幅）。D–H) 针对A所列基因型观察到的平均电生理表型定量分析。D) 微型兴奋性接头电流振幅 E) 微型兴奋性接头电流频率 F) 平均兴奋性接头电流振幅 G) 平均量子含量（兴奋性接头电流振幅/微型兴奋性接头电流振幅） H) 平均易化比。*表示采用单因素方差分析结合Tukey事后检验在* p<0.05或*** p<0.001水平存在显著差异。
04.靶向其他外囊亚基的RNAi同样引起与sec15相似的形态缺陷
在酵母中，完整的囊泡分泌过程需要整个外囊复合体参与。先前研究果蝇视网膜神经元中sec15破坏效应时发现一个有趣现象：Sec15的功能作用并不需要完整的外囊复合体。该研究发现，在某些情况下，包含Sec15、Sec5和Sec8（但不含Sec6）的亚复合体可能介导外囊功能。这一结果提示外囊亚复合体可能对介导部分先前认为与整个外囊复合体相关的效应具有重要作用。为探究其他外囊亚基的可能贡献，研究人员利用靶向其他外囊亚基的RNAi转基因，检测它们能否重现Sec15敲低所见的形态表型。
研究发现，其他多种外囊亚基的RNAi确实能重现该表型。针对sec5、sec10和exo84的RNAi转基因表达能够引起活性区组分BRP的错误定位，其表型与UAS-sec15 RNAi相似。在突触前神经元中驱动针对sec5、sec6、sec10和exo84的UAS-RNAi转基因可显著增加神经肌肉接头分支数量。除exo70外，所有测试的外囊亚基均显著促进卫星样突触小结的形成。事实上，针对外囊亚基exo70的RNAi转基因未能重现任何突触形态表型。但这并不排除exo70作为复合体组成部分的可能性，因为某些RNAi转基因可能无法有效降低其靶蛋白水平。此外，Exo70已被证实与果蝇神经肌肉接头生长相关。因此，在果蝇神经肌肉接头处，并非类似视网膜中发现的特定外囊蛋白亚复合体，而更可能是整个外囊复合体共同维持突触的正常形态。
图5. 针对外囊复合体多种组分的UAS-RNAi同样引起与UAS-sec15 RNAi相似的形态表型。A) 果蝇三龄幼虫肌肉4神经肌肉接头共聚焦图像。样品经HRP（蓝色）、BRP（红色）及GluRIII（绿色）抗体标记。图示为从左至右依次表达针对不同外囊亚基UAS-RNAi幼虫的神经肌肉接头代表性图像，包括sec3、sec5、sec6、sec8、sec10和exo84。比例尺为20微米。B–D) 柱状图显示对照组幼虫与A所列外囊亚基RNAi幼虫的平均形态指标，包括：B) BRP簇对应的谷氨酸受体簇百分比，C) 每个神经肌肉接头平均分支数，D) 每个神经肌肉接头平均卫星样突触小结数。误差线代表标准误。*表示采用单因素方差分析结合Tukey事后检验在p<0.05、** p<0.01或*** p<0.001水平存在显著差异。针对27483号实验品系采用学生t检验，因该实验独立进行。
05.Rab11 RNAi敲低模拟sec15敲低的形态与生理效应
sec15敲低后出现的分支增多和卫星样突触小结增加现象，使人联想到囊泡内吞与再循环通路中的多种突变表型。该通路中的一种关键蛋白是Rab11，这是一种定位于再循环内体的囊泡相关Rab蛋白。Rab11缺失会导致卫星样突触小结增多，且Rab11可与Sec15共定位并相互结合。因此，研究人员提出假设：Sec15可能通过与Rab11的相互作用来调控神经肌肉接头形态与生理功能。若该假设成立，则Rab11敲低应能模拟Sec15敲低效应。
为比较Rab11与Sec15缺失引起的发育与功能缺陷，研究人员利用elav-Gal4在神经元中表达UAS-Rab11 RNAi转基因，特异性敲低突触前Rab11。结果发现，神经元中敲低Rab11产生的表型与Sec15敲低几乎无法区分。形态学上，UAS-rab11 RNAi表达降低了BRP对应的谷氨酸受体簇百分比，并导致神经肌肉接头分支和卫星样突触小结数量急剧增加。此外，突触前Rab11缺失引发的突触生理缺陷与Sec15缺失几乎完全相同。与对照组相比，Rab11敲低导致微型兴奋性接头电流频率大幅下降，且UAS-rab11 RNAi表达引起的兴奋性接头电流振幅与量子含量降低程度与Sec15敲低观察结果相似。不过，Rab11敲低组的微型兴奋性接头电流振幅较对照组略有增加，而这一现象未在Sec15敲低组中出现。这一突触功能的微小差异可能提示Rab11与Sec15存在部分独立功能，也可能仅是两种不同RNAi构建体敲低水平对该特定表型的敏感性差异。然而，Sec15敲低后观察到的绝大多数形态与功能表型均能被Rab11敲低所模拟，表明这两种蛋白通过共同机制发挥作用。同时敲低Rab11与Sec15会导致个体在三龄幼虫阶段前死亡。
图6. Sec15敲低表型可由Rab11敲低模拟。A) 肌肉4神经肌肉接头1b型突触小结代表性共聚焦图像。样品经HRP（蓝色）、BRP（红色）及GluRIII（绿色）抗体标记。图示为对照组幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/+）或UAS-rab11 RNAi转基因幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/+; UAS-rab11 RNAi 27730/+）的神经肌肉接头代表性图像。比例尺为20微米。B) A所列基因型肌肉4第1b型突触小结放大共聚焦图像。图像经α-BRP（红色）与α-GluRIII（绿色）标记。比例尺为2微米。C–E) 野生型与UAS-rab11 RNAi 27730品系的BRP斑点对应GluRIII簇百分比、轴突分支数/神经肌肉接头及卫星样突触小结数/神经肌肉接头柱状图。F) A所列基因型第6号肌肉在-70 mV钳制电位下自发性兴奋电流的代表性记录。G) A所列基因型单次超阈值电脉冲诱发刺激电流的代表性记录。图示为连续10次刺激的平均电流波形。H–L) 显示A所列基因型突触生理各项指标的柱状图，包括：H) 微型兴奋性接头电流振幅，I) 微型兴奋性接头电流频率，J) 兴奋性接头电流振幅，K) 释放的突触囊泡数（量子含量），L) 连续五次高频刺激引起的突触电流易化（易化比）。误差线代表标准误。*表示采用单因素方差分析结合Tukey事后检验在p<0.05、** p<0.01或*** p<0.001水平存在显著差异。
06.Sec15敲低导致BMP信号通路增强
果蝇神经肌肉接头突触发育的一个关键调控因子是骨形态发生蛋白信号通路。在该通路中，肌肉产生的信号分子Glass bottom boat被释放，并与运动神经元上的受体复合体结合。该受体复合体由酪氨酸激酶受体Wishful thinking、Thick veins和Saxophone组成。受体结合后，胞质蛋白Mothers against decapentaplegic被磷酸化并转运至细胞核调控基因表达。该信号通路的激活确保了幼虫发育期间突触神经元部分的正常扩展。通过阻断内吞与再循环通路或移除抑制性调控因子如daughters against decapentaplegic可增强该通路。BMP信号通路激活会导致突触前发育改变，其特征是出现大量卫星样突触小结和神经末梢分支增多。
由于Sec15敲低的许多形态表型也常见于BMP信号通路过度激活的情况，研究人员通过检测神经肌肉接头中磷酸化Mad水平来探究BMP信号通路的参与程度。Mad被激活的BMP受体复合体磷酸化，因此BMP通路激活时pMad水平会升高，此效应被认为是判定BMP通路参与的关键指标。研究发现，神经元中表达UAS-sec15 RNAi转基因确实导致神经肌肉接头pMad水平显著升高。为确认该升高是否通过BMP信号通路介导，研究人员在与sec15 RNAi共表达的同时，加入了靶向敲低Wit受体的第二种RNAi。有趣的是，敲低突触前BMP受体Wit完全阻断了UAS-sec15 RNAi诱导的pMad水平升高，表明sec15诱导的pMad增强确实通过BMP信号通路介导，同时也证明了UAS-wit RNAi转基因消除BMP信号的有效性。
图7. Sec15敲低中BMP信号蛋白Mad磷酸化形式水平升高。A) 野生型幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/+）、表达UAS-sec15 RNAi转基因幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/UAS-sec15 RNAi105126）或共表达UAS-sec15 RNAi与UAS-wit RNAi转基因幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/UAS-sec15 RNAi105126; UAS-wit RNAi25949/+）的肌肉4神经肌肉接头共聚焦图像。幼虫经α-HRP（蓝色）、α-BRP（红色）与α-pMad（绿色）标记。B) 单独野生型幼虫（+/+）或endophilinA突变幼虫endoAEYO2730（endoAEYO2730/endoAEYO2730）肌肉4神经肌肉接头共聚焦图像。C) 根据A所列基因型统计的突触pMad抗体信号平均强度柱状图。*表示采用单因素方差分析结合Tukey事后检验在p<0.05水平存在显著差异。D) 根据B所列基因型统计的突触pMad抗体信号平均强度柱状图。*表示采用学生t检验在p<0.05水平存在显著差异。
与先前其他BMP激活剂研究观察到的水平相比，pMad蛋白水平的增强相对有限。为评估Sec15敲低引起的pMad增强程度，研究人员同时检测了先前被证实能显著增强pMad的endophilinA突变体中的pMad水平。结果显示，endophilinA突变体引起的pMad升高程度与Sec15敲低观察到的水平相似。因此，sec15缺失确实增强了BMP信号通路，且该增强效应可通过RNAi敲低BMP受体wit被完全阻断。
07.阻断BMP信号可减轻Sec15敲低导致的多种形态缺陷（但非全部）
鉴于已证实Sec15缺失会激活BMP信号通路，研究人员希望进一步确定Sec15敲低后出现的哪些具体表型可归因于BMP信号增强。为此，首先使用了针对BMP受体Wit的RNAi转基因。单独表达UAS-wit RNAi对神经肌肉接头形态无显著影响，但同时表达UAS-wit RNAi与UAS-sec15 RNAi可显著减少单独表达UAS-sec15 RNAi时通常出现的分支数量和卫星样突触小结形成。这表明这些表型至少部分源于Sec15敲低介导的BMP信号增强，而非Sec15缺失的直接效应。
有趣的是，并非所有形态表型都得到减轻。sec15 RNAi-wit RNAi双敲低动物中BRP对应的谷氨酸受体簇百分比与单独表达UAS-sec15 RNAi动物相似。这一结果提示Sec15敲低具有两种可区分的效应：对应表型可能是Sec15缺失的直接效应，而分支和卫星样突触小结形成表型则是Sec15敲低通过增强BMP信号通路产生的间接效应。
图8. 敲低BMP受体Wishful thinking可减轻sec15敲低导致的形态缺陷。A) 果蝇三龄幼虫肌肉4神经肌肉接头共聚焦图像。样品经HRP抗体标记（白色）。图示为野生型幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/+）、表达UAS-sec15 RNAi转基因幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/UAS-sec15 RNAi105126）、同时表达UAS-sec15 RNAi与UAS-wit RNAi转基因幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/UAS-sec15 RNAi105126; UAS-wit RNAi25949/+）及单独表达UAS-wit RNAi转基因幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/+; UAS-wit RNAi25949/+）的神经肌肉接头代表性图像。比例尺为20微米。B) A所列基因型肌肉4第1b型突触小结放大共聚焦图像，显示BRP（红色）与GluRIII（绿色）染色。比例尺为2微米。C–E) 根据A所列基因型统计的神经肌肉接头多项形态指标定量，包括：C) 每个神经肌肉接头平均分支数，D) 每个神经肌肉接头平均卫星样突触小结数，E) BRP斑点对应的谷氨酸受体簇百分比。F) 所列基因型的代表性微型兴奋性接头电流及G) 兴奋性接头电流记录。H–J) 根据所列基因型统计的若干电生理特性定量。所有统计图中，*表示采用单因素方差分析结合Tukey事后检验在p<0.05、** p<0.01或*** p<0.001水平存在显著差异。
我们进一步测试了Wit敲低对Sec15敲低中突触传递的影响。由于Wit敲低未影响突触对应缺陷，我们推测其可能同样不影响突触生理缺陷。先前发现的BMP增强突变体daughters against decapentaplegic虽表现出神经肌肉接头形态扩展与不规则，但兴奋性接头电流大小无变化，这表明BMP信号增强本身不引起突触生理缺陷。研究发现，与突触对位情况类似，Sec15敲低中的微型兴奋性接头电流频率和兴奋性接头电流振幅均未因同时敲低Wit而得到挽救，说明这些表型正如假设，独立于BMP信号增强，可能直接源于Sec15缺失。单独表达UAS-wit RNAi会导致兴奋性接头电流幅度减小，因此对于兴奋性接头电流表型，尚不清楚Wit敲低是未能挽救该表型，还是通过Wit受体缺失引发的其他机制额外降低了兴奋性接头电流。然而，微型电流频率的结果是明确的，提示突触传递缺陷由Sec15缺失直接引起，而非BMP信号增强的间接效应。
使用多个UAS构建体时可能出现Gal4蛋白被滴定的问题。但研究发现，同时表达靶向BMP受体复合体另一成员saxophone的UAS-RNAi与sec15 RNAi，对Sec15敲低引起的分支和卫星样表型完全无效。因此，同时表达wit RNAi所观察到的sec15表型减轻并非Gal4滴定所致。
08.利用wit无效突变阻断BMP信号不能完全消除Sec15敲低诱导的形态表型
我们发现，通过RNAi阻断Wit受体介导的BMP通路可完全消除pMad形成，并部分减轻Sec15敲低后观察到的分支和卫星样突触小结表型。尽管由于pMad增强完全消除，分支和卫星样表型的部分挽救不太可能源于RNAi转基因对Wit蛋白的不完全敲低，但为排除此可能性，我们使用wit无效突变背景重复了实验，该背景下所有Wit蛋白理论上均不存在。在witA12/B11突变背景中表达UAS-sec15 RNAi转基因。与先前研究一致，witA12/B11突变体的神经肌肉接头尺寸和分支数显著减小。在wit突变背景中表达UAS-sec15 RNAi后，神经肌肉接头仍保持较小尺寸且分支与卫星样结构稀少，这再次表明这些表型可能源于BMP信号增强。然而，与单独wit突变相比，卫星样结构数量仍显著增加。由于wit突变幼虫神经肌肉接头尺寸大幅减小，我们对尺寸校正后的形态变化进行了量化。经神经肌肉接头面积标准化后，发现卫星样结构形成的增加幅度与野生型背景中表达UAS-sec15 RNAi时相似。总之，阻断BMP信号通路能够减轻但无法完全消除突触前sec15缺失导致的所有形态效应。部分效应持续存在的事实表明，虽然某些Sec15敲低缺陷可能由BMP信号增强引起，但卫星样突触小结的形成至少部分独立于BMP信号增强，可能直接源于Sec15缺失。
图9. BMP受体wishful thinking突变可减轻但无法完全消除sec15敲低导致的形态缺陷。A) 野生型幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/+）、表达UAS-sec15 RNAi转基因幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/UAS-sec15 RNAi105126）、在wit突变背景中表达UAS-sec15 RNAi幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/UAS-sec15 RNAi (105126); witA12/witB11）及单独wit突变幼虫（elav-Gal4, UAS-DCR2/+; witA12/witB11）的肌肉4神经肌肉接头α-HRP（蓝色）、α-BRP（红色）与α-GluRIII（绿色）标记共聚焦图像。比例尺为20微米。B) A所列基因型肌肉4突触小结放大共聚焦图像。突触小结经α-GluRIII（绿色）与α-BRP（红色）染色。比例尺为2微米。C–F) 根据A所列基因型统计的神经肌肉接头多项形态指标柱状图，包括：C) 每个神经肌肉接头平均分支数，D) 每个神经肌肉接头平均卫星样突触小结数，E) 平均神经肌肉接头面积，F) 单位神经肌肉接头面积的卫星样突触小结数。所有统计图中，*表示采用单因素方差分析结合Tukey事后检验在p<0.05、** p<0.01或*** p<0.001水平存在显著差异。
09.Sec15敲低导致神经元细胞外囊泡释放缺失
在Sec15敲低实验过程中，我们注意到通常围绕在突触前神经末梢周围的点状HRP染色出现缺失。这种点状染色被归因于突触前神经元释放的细胞外囊泡。突触前来源蛋白Neuroglian的染色也被证实是衡量细胞外囊泡释放的良好指标。我们通过比较Sec15敲低与对照组中HRP或Nrg染色强度，对细胞外囊泡释放缺失进行了定量分析。结果发现，与对照组相比，Sec15敲低样本中突触前神经元周围区域的HRP与Nrg阳性细胞外囊泡染色均显著减少，表明Sec15在该突触的细胞外囊泡释放过程中也发挥作用。为验证Sec15敲低的特异性，我们通过表达RNAi抗性sec15来挽救RNAi诱导的细胞外囊泡表型，发现突触前表达Sec15能够完全恢复这些突触的细胞外囊泡释放功能。
图10. Sec15敲低导致细胞外囊泡释放减少。A) 野生型与sec15 RNAi幼虫神经肌肉接头代表性图像。神经肌肉接头经α-HRP与α-GluRIII（绿色）染色。比例尺为10微米。B) A图框选区域放大图像。比例尺为2.5微米。C) 突触前神经元邻近区域HRP染色定量分析。D) 野生型与sec15 RNAi幼虫神经肌肉接头代表性图像。神经肌肉接头经α-neuroglian（NRG，红色）与α-GluRIII（绿色）染色。比例尺为10微米。E) D图框选区域放大图像。比例尺为2.5微米。F) 突触前神经元邻近区域Neuroglian染色定量分析。G) 对照组（左）、UAS-sec15105126 RNAi组（中）及UAS-sec15105126 RNAi + RNAi抗性UAS-sec15组（右，挽救组）的HRP染色代表性图像。H) 根据G所列条件统计的突触后HRP定量分析。所有统计图中，*表示采用单因素方差分析结合Tukey事后检验在** p<0.01或*** p<0.001水平存在显著差异。
Rab11 RNAi同样引起HRP与Neuroglian染色减少，这与先前关于Rab11参与细胞外囊泡释放的报道一致。因此，Rab11与Sec15均参与该突触处细胞外囊泡的形成和/或释放过程。
四、讨论
外囊蛋白复合体已被证明对酵母的分泌过程必不可少。在后生动物系统中，该复合体并非多种囊泡融合所必需，而似乎进化成为将囊泡靶向至特定位点以递送膜脂质与蛋白质的机制。本研究表明，敲低Sec15会导致果蝇神经肌肉接头出现一系列重要缺陷，包括关键突触蛋白的错误定位、自发性与刺激诱发突触囊泡释放缺陷、细胞外囊泡释放缺陷，以及无法形成正常的神经肌肉接头突触分支结构。我们还发现rab11敲低表型与sec15敲低几乎完全相同，提示这两种基因产物通过同一分子通路确保果蝇神经肌肉接头结构与功能的正常发育。Rab11囊泡主要与再循环内体及细胞外囊泡释放相关，这表明Rab11或Sec15的缺失会特异性阻断：1）从再循环内体至细胞表面的囊泡运输；2）细胞外囊泡形成或释放的相关机制。
01. 外囊在神经肌肉接头中的作用机制
外囊在Rab11囊泡运输中的作用已被提出可协助维持上皮细胞极性、再循环转铁蛋白受体以及在迁移的果蝇边界细胞前缘维持受体酪氨酸激酶。在所有案例中，再循环内体对于维持蛋白质在细胞表面关键位置的定位至关重要。我们的研究可能存在类似机制：再循环内体负责运输神经元表面的蛋白质和脂质并进行精确定位。在本研究中，突触BRP水平降低，而这种蛋白质（可能还包括其他重要突触蛋白）的缺失可能导致观察到的生理缺陷。由于从再循环内体至质膜的物质运输过程可受调控，我们的结果突显了调控神经元突触强度的潜在重要机制。
我们还证明，神经肌肉接头中外囊功能的缺失会导致BMP信号增强（通过神经肌肉接头pMad水平升高检测），其机制可能是激活的BMP受体因内体运输通路受阻而滞留在激活状态。BMP信号增强可被Wit受体敲低完全阻断。但即使在此情况下，sec15 RNAi表达引发的许多表型变化依然存在，这表明Sec15缺失具有更直接的影响。sec15 RNAi介导的形态表型持续存在不太可能源于RNAi对Wit受体清除不完全，因为在wit无效突变体中同样观察到这些形态表型。这些结果表明，尽管外囊缺失的次要效应——BMP信号增强确实促进了分支和卫星样结构形成，但外囊缺失本身也直接导致这些表型。我们提出，当BMP信号增强时观察到的卫星样表型加剧，可能是神经肌肉接头分支生长受刺激与Sec15介导的囊泡融合靶向特异性丧失共同作用的结果。这导致突触分支结构更随机且非典型化。相反，BRP阳性突触的缺失以及功能性突触缺陷似乎完全独立于BMP信号增强，提示Sec15直接参与BRP阳性活性区的发育或维持。另一种可能是Sec15缺失也以类似增强BMP信号的方式增强wingless或其他细胞信号通路。Wg信号增强已被证明会导致卫星样突触小结形成，并改变BRP阳性活性区的分布。有趣的是，我们未观察到在其他神经元制备中常见的轴突导向缺陷。这些事件可能发生在Sec15敲低前的发育阶段，或者RNAi诱导敲低后残留的微量Sec15足以完成该任务。这也凸显了在果蝇神经肌肉接头使用RNAi研究外囊的固有优势，因为轴突导向缺陷会妨碍对外囊在发育后期必需功能的表征。
02.外囊与Rab11功能缺失导致突触生理缺陷
本研究通过在神经元中特异性敲低Sec15，发现外囊缺失可同时影响自发性与诱发型神经传递。由于Rab11敲低能模拟此处的突触传递效应，其机制很可能同时涉及外囊与Rab11。尽管RNAi抗性Sec15过表达未能完全挽救该表型，但基于三种独立sec15 RNAi构建体及rab11 RNAi构建体均呈现相同表型，我们认为兴奋性接头电流振幅降低是Sec15蛋白缺失的直接结果。目前尚不清楚为何许多早期研究未观察到类似的突触传递减弱现象。一种可能是Sec15在其他突触（如另一项sec15研究中使用的视网膜突触）中发挥不同作用。一项在果蝇神经肌肉接头中使用靶向外囊亚基sec10的RNAi研究并未显示对兴奋性接头电流振幅的影响，且该研究中sec10 RNAi也未表现出任何突触形态变化，这可能提示该研究中RNAi效率较低，因为我们的sec10 RNAi对形态有明确影响。其他可能性包括不同亚基对突触传递的差异化效应。有研究者推测，其研究中使用的exo70无效突变体不致死的原因可能是外囊在没有该亚基时仍能以较低水平运作，因此某种程度上该亚基并非绝对必需。最终可能发现，外囊的某些亚基对所有功能不可或缺，而其他亚基仅对该蛋白复合物的特定功能关键，或在整体上更可替代。最后，另一种可能是不同研究使用的钙离子浓度差异。本研究中采用的较低钙离子浓度可能揭示了在较高钙离子浓度下可被掩盖的缺陷。我们计划在未来研究中进一步表征Sec15对突触囊泡动力学及突触传递钙离子依赖性的影响。
那么Sec15与Rab11如何影响突触囊泡释放？Rab11介导的事件直接参与突触囊泡释放后期过程（如锚定与启动）的可能性似乎较低，因为这些囊泡主要与Rab3相关，但也不能完全排除该可能性。有趣的是，Rab11敲低对突触传递的影响远大于Rab3缺失。Rab11也与突触囊泡相关联，并参与某些形式的突触囊泡再循环。Sec15和Rab11可能并非直接作用于突触囊泡释放，而是通过调控突触囊泡运输与可用性的机制间接影响其释放。一种可能性是对需经由内体区室运输的突触囊泡再循环过程产生影响。在这种情况下，突触囊泡再循环的某个步骤需要Rab11和Sec15参与，或者后期再循环步骤的缺失进而影响其他内体区室中更上游的运输事件。
另一种可能解释突触传递减弱的假设是：通常由再循环内体或细胞外囊泡提供给活性区的蛋白质或脂质出现缺失。这些因子对释放位点本身的发育或维持至关重要，其缺失可能类似于上皮细胞中外囊功能缺失导致的基底侧E-钙黏蛋白丢失。支持这一观点的是，我们观察到部分活性区中BRP水平降低。含BRP活性区的缺失可能导致突触强度减弱，因为已知BRP缺失会降低突触传递。然而，Sec15或Rab11敲低各自诱发的囊泡释放减少程度远超此处观察到的这些活性区功能丧失所能解释的范围，因为BRP完全缺失会导致兴奋性接头电流振幅下降70%且自发性频率无变化，而我们观察到约50%的下降且BRP浓度变化相对较小。未来实验需进一步阐明外囊在突触功能中作用的机制，这可能从根本上改变我们对突触囊泡组织与运动的理解。
03.细胞外囊泡释放
细胞外囊泡（外泌体与微囊泡）已被证明是跨突触信号传递的重要机制。本研究报告的一个有趣结果是，突触前敲低Sec15或Rab11均导致突触后区域细胞外囊泡减少。Rab11影响细胞外囊泡信号传递的能力此前已有报道，但本研究将这一作用扩展至Sec15。目前对细胞外囊泡释放的具体机制知之甚少，但很可能涉及多囊泡体靶向融合至细胞膜并释放其内部囊泡的过程。未来工作需要进一步明确Sec15信号传递中涉及的囊泡具体类型，以及该过程中利用的特定货物与外囊亚基。
五、结论
本研究揭示了外囊在运动神经元中的功能：促进突触分支结构形成及建立正确的突触连接。结果表明，Sec15介导的胞吐作用缺失导致突触出现广泛缺陷，提示sec15通过直接与间接途径参与突触发育与维持的多个方面。我们提出一个模型：Sec15与Rab11协同作用，协助物质从再循环内体运输至神经元质膜，同时促进细胞外囊泡释放及与突触后细胞的正常细胞外囊泡信号传递。
Rab11已被证明参与阿尔茨海默病Aβ肽的积聚，并与晚发性阿尔茨海默病存在遗传关联。Rab11还与亨廷顿基因存在相互作用，其正常功能破坏在疾病进展中至关重要。在果蝇中，致病性亨廷顿蛋白表达会破坏内体运输并增强BMP信号，而过表达Rab11能够克服该亨廷顿病模型中的突触缺陷。此外，Rab11对HeLa细胞、N2a细胞及果蝇神经肌肉接头中淀粉样前体蛋白的运输具有重要作用。因此，由Rab11和外囊介导的靶向释放通路可能在哺乳动物突触功能以及阿尔茨海默病、亨廷顿病等疾病的进展中扮演重要角色。此外，我们的发现揭示了通过再循环内体调控囊泡运输与融合来实现突触可塑性的潜在重要机制。
深圳市富临神通科技有限公司（原“东莞市富临塑胶原料有限公司”）是 AMPI中国代理商，采购Master-8、Master-9等电刺激产品请立即联系我们。
发布于：河南省翻翻配资提示：文章来自网络，不代表本站观点。
相关文章
热点资讯
